L'Ifremer communique
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Lettre aux Médias n° 57Février 2000Les microorganismes marinsSommaire :
Les microorganismes marins, perspectives industrielles Les biotechnologies offrent actuellement des outils qui peuvent être utilisés pour les recherches sur le milieu marin et ce milieu, porteur d’une grande diversité, peut être considéré comme un vaste gisement de molécules exploitables à des fins biotechnologiques qu’elles soient scientifiques ou industrielles. L’Ifremer a donc orienté, dès la fin des années 80, une partie de ses activités en microbiologie dans le but de l’explorer. Des études ont permis d’envisager le milieu hydrothermal, situé par des fonds de 1000 à 4000 mètres, comme particulièrement favorable. Ses moyens d’investigation (navires et engins submersibles) lui permettaient d’y accéder, les caractéristiques extrêmes du milieu autorisant une recherche originale. L’étude des microorganismes de ces milieux extrêmes est intéressante dans la mesure où elle a été, jusqu’à récemment, largement ignorée. Certaines espèces se sont révélé, par ailleurs, aisément cultivables. On peut penser trouver dans les fonds sous-marins des groupes d’espèces qui n’existent pas forcément sur terre. La possibilité de croissance par forte température est la piste d’études la plus importante. Restait à vérifier que les hautes pressions (du fond) ne sont pas une condition indispensable à la croissance de ces organismes. C’est ce qui a été fait par l’Ifremer dans le cadre d’une coopération scientifique (1997-1999) avec les chercheurs japonais, les seuls actuellement à posséder un équipement permettant de vérifier ce point très important pour les industriels, futurs utilisateurs. Que ce soit pour la production d’exopolysaccharides ou pour la mise en évidence de nouvelles enzymes originales, des contrats de recherche en collaboration ont été conclus avec des industriels nationaux ou européens. Ces travaux ont abouti à la découverte et à la mise sur le marché de polymérases thermostables (Eurogentec), à la mise en évidence d’enzymes pour usage direct par les partenaires industriels (amidonnerie), au développement de polysaccharides à fonction rhéologique (groupe agro-alimentaire Even), et au lancement d’un produit actif pour la cosmétologie. Dans le but de protéger les intérêts scientifiques de l’Ifremer tout en garantissant à l’industrie la possibilité d’exploiter les résultats, les produits obtenus sont protégés, dès que possible, par un brevet. A ce jour, l’Ifremer est titulaire ou co-titulaire de 7 brevets princeps (19 brevets étendus) couvrant 23 molécules originales. L’Ifremer a également concédé à la société nouvellement créée, Proteus, un droit d’usage de la collection de souches hydrothermales afin qu’elle l’intègre dans sa recherche systématique ("screening") d’enzymes industrielles. Une stratégie similaire pourrait, dans un futur proche, amener l’Institut à soutenir la création d’une start-up pour le développement des polysaccharides.
* celui qui existe au Jamstec (équivalent japonais de l’Ifremer) et qui a nécessité un budget de l’ordre de 40 MF. Il permet de pratiquer des essais à hautes pressions sur des souches bactériennes. Identification des microorganismes hydrothermaux, découverte d’un genre nouveau Deux jeunes chercheurs utilisent la biologie moléculaire pour décrire la biodiversité de la microflore des sources hydrothermales. La recherche des micro-organismes s’effectue traditionnellement par des cultures d’enrichissement, dans des conditions fixées par l’expérimentateur. Dans ce cas, seules les espèces cultivables sont détectées. Les techniques de biologie moléculaire ont récemment permis d’aller plus loin. Les espèces microbiennes sont identifiables par comparaison de leurs séquences d’ADN ribosomique 16S, gène existant chez tous les micro-organismes. Il comporte certaines zones variables, permettant la classification des espèces sur un arbre phylogénétique. Il est possible de procéder à une amplification de cette portion d’ADN à partir de l’ADN total extrait d’un échantillon, par la technique de PCR, couramment utilisée dans les laboratoires d’analyse biologique. Les ADNr 16S obtenus en mélange sont alors séparés puis séquencés. Les séquences d’ADN sont comparées à celles des banques de données disponibles. Cela permet de situer les gènes obtenus : espèce connue ou inconnue, genre nouveau. C’est ainsi que la souche MV1075, appartenant à la collection de micro-organismes de l’Ifremer, a été choisie pour modèle. En septembre 1997, le sous-marin Nautile remonte un morceau de cheminée hydrothermale du site Menez-Gwen, situé sur la dorsale médio-Atlantique au large des Açores, à près de 1000 m de profondeur. Une fois la souche mise en culture, l’analyse de l’ADN indique qu’il peut s’agir d’un représentant d’un nouveau genre de bactérie. Mais l’ADN n’est qu’un premier indice, d’autres techniques doivent être utilisées pour décrire la souche et déterminer son originalité. La morphologie, les conditions de culture optimales (pH, température, salinité), l’effet des antibiotiques, les caractéristiques métaboliques (quelles molécules sont consommées et produites par la bactérie lors de sa croissance ? etc), autant de critères qui permettent de cerner la personnalité de la souche et d’établir une vraie fiche signalétique. La comparaison de MV1075 avec les souches proches disponibles a permis de valider son appartenance à un nouveau genre de bactérie thermophile. Il s’agit ensuite d’évaluer si cette originalité taxonomique s’accompagne d’une originalité des activités enzymatiques susceptibles d’intéresser les industriels (enzymes thermostables tels les amylases utilisées dans les lessives ou les xylanases utilisées dans le blanchiment de la pâte à papier). L’intérêt de l’étude est aussi écologique. A chaque nouvelle souche isolée ou nouvel ADNr 16S séquencé, la compréhension du monde microbien et son incroyable biodiversité se trouvent modifiées. Ainsi, les deux espèces les plus proches de la souche MV1075, ses "cousines", proviennent curieusement toutes deux de puits de pétrole de l’Oklahoma et du Texas ! La proximité de souches issues d’écosystèmes a priori tellement différents a fait émerger le concept d’une biosphère souterraine, véritable monde microbien profond, dont les puits de pétrole et les sources hydrothermales abyssales constituent des fenêtres entrouvertes. Aux chercheurs de les ouvrir un peu plus ...
Un nouvel outil de reconnaissance d’une espèce toxique : le cas de Dinophysis Une application particulière des outils moléculaires de détection (une sonde ADN) est testée actuellement pour l’identification d’une espèce toxique, Dinophysis acuminata. Celle-ci est susceptible de provoquer épisodiquement des phénomènes diarrhéiques en cas d’ingestion par l’homme de coquillages contaminés. Entrepris par une jeune chercheuse en post-doc à l’Ifremer de Brest, ce travail comporte deux parties distinctes. La première consiste à étudier tous les morphotypes connus de Dinophysis a. c’est-à-dire les différentes formes qu’il peut revêtir, suivant la saison et l’endroit où il est repéré. Nous savons qu’au printemps, il est plus gros, rondouillard même ; qu’en été il est plus petit, de forme allongée et que vers le mois d’octobre, il aura tendance à grossir à nouveau. La question qui se pose alors est : "S’agit-il toujours de la même espèce, sous des formes différentes ?". Les techniques d’analyse des séquences de l’ADN permettent d’y répondre par l’affirmative, il s’agit bien, dans tous les cas, de Dinophysis acuminata. La seconde partie du travail porte sur l’élaboration d’un outil moléculaire de détection du plancton toxique, plus précis et plus rapide que les méthodes classiques d’observation des cellules au microscope. Une sonde capable de détecter l’algue toxique, même à très faibles concentrations, est à l’étude. Cette technique, très utilisée en microbiologie, commence à être appliquée aux algues, en particulier aux algues toxiques. Le problème de Dinophysis acuminata réside dans le fait qu’il peut s’avérer toxique à moins de 100 cellules par litre d’eau de mer et il est alors difficilement détectable par les méthodes traditionnelles d’observation au microscope. En effet, sachant qu’il peut être toxique à moins de 100 cellules par litre et que l’on utilise des tubes contenant 10 mL, le repérage doit donc s’effectuer sur... une seule cellule. Difficile de ne pas passer à côté ! Le nouvel outil moléculaire permet de détecter des densités de 30 cellules par litre. Les chercheurs envisagent maintenant de travailler sur d’autres espèces toxiques comme Alexandrium minutum, dont les toxines sont, elles, paralysantes. Dans ce cas, au problème de sensibilité de détection de l’algue toxique s’ajoute un problème de reconnaissance spécifique. En effet, les espèces du genre Alexandrium sont très difficiles à distinguer les unes des autres à l’aide d’un simple microscope. Une sonde moléculaire serait un moyen de reconnaissance infaillible. De plus il permettrait de donner l’alerte plus rapidement. L’outil, une fois rôdé, pourrait servir en routine aux analyses de l’Ifremer, dans le cadre de son réseau de surveillance littoral et dans les autres pays concernés par les efflorescences de ces algues toxiques.
* ADN : Acide désoxyribonucléique Une bactérie thermophile au secours de la PCR ...
L’une des techniques de biologie moléculaire les plus utilisées, dans de nombreux domaines (santé, agro-alimentaire, etc) est la technique dite de PCR (Polymerase Chain Reaction), réaction permettant d’amplifier in vitro des fragments d’ADN de façon à en obtenir une quantité suffisante pour l’étudier. Ces réactions d’amplification de l’ADN sont catalysées in vitro par une enzyme thermostable appelée ADN polymérase de type I. Comme toute technique, celle-ci présente des limites qu’il conviendrait de repousser. Les principales sont, d’une part, la longueur du fragment d’ADN que peut répliquer l’ADN polymérase thermostable, dans le meilleur des cas 40 kb environ, et, d’autre part, le taux d’erreurs non négligeable réalisées par l’enzyme lors des réactions de polymérisation. Les industriels souhaiteraient pouvoir répliquer des séquences beaucoup plus longues (supérieures à 100kb) et dont la séquence nucléotidique serait conforme à la molécule mère d’ADN. La stratégie classique, pour améliorer le système de PCR, consiste à agir sur l’enzyme par mutagénèse afin d’en améliorer les propriétés de processivité et de fidélité. L’idée, née à l’Ifremer dans le laboratoire de Biotechnologies des Micro-organismes Hydrothermaux, porte non pas sur l’amélioration des ADN polymérases de type I, mais sur la recherche de facteurs protéiques (facteurs de réplication thermostables) pouvant interagir avec l’enzyme afin d’en améliorer in vitro les performances. Par ailleurs, le génome complet de la souche hyperthermophile, Pyrococcus abyssi qui appartient à l’Ifremer, a été complètement séquencé par le Génoscope et annoté. Ceci a permis de découvrir qu’il existait un autre ADN polymérase de type II. Sans entrer dans le détail, les chercheurs pensent que ces nouvelles ADN polymérases (de type II) sont celles qui seraient responsables in vivo de la réplication de l’ADN et pourraient permettre la mise en place d’un système homologue, cette fois in vitro, de réplication de l’ADN. Il n’est pas utopique de penser y parvenir en utilisant comme modèle une archaebactérie hyperthermostable telle que Pyrococcus abyssi, dont on connaît parfaitement la séquence du génome et dont plusieurs gènes codant pour des facteurs de réplication ainsi que pour l’ADN polymérase II ont déjà été clonés et exprimés au laboratoire. Le gain essentiel recherché est une plus grande capacité à synthétiser in vitro de longs, voire de très longs, fragments d’ADN tout en réduisant le nombre d’erreurs d’incorporation de nucléotides dans les molécules d’ADN synthétisées. Outre l’intérêt que présentent la recherche et l’étude de telles nouvelles enzymes plus performantes et de facteurs de réplication pour réaliser des PCR sur de très longs fragments d’ADN, ces mêmes outils se révèlent également particulièrement importants pour être utilisés dans des programmes de séquençage de génomes complets tel le génome humain, par exemple.
* polymérase :
enzyme capable d’enchaîner des nucléotides en polymères d’ADN ou d’ARN. Les enzymes du fond des océans intéressent les industriels Récoltés au fond des océans lors des campagnes de plongée des submersibles habités de l’Ifremer, les microorganismes marins extrêmophiles intéressent les industriels. Ce sont particulièrement les enzymes et leur potentiel qui les intéressent, leur résistance à des conditions extrêmes leur ouvrant des domaines d’application interdits aux enzymes usuelles. En effet, les produits existant sur le marché (traditionnellement issus de microorganismes d’origine terrestre : levures ou champignons) ne répondent pas toujours parfaitement aux attentes. Soit la réaction provoquée est incomplète, soit elle se fait à une certaine température mais l’on souhaiterait qu’elle puisse se faire aussi dans certaines autres conditions de pH (très acide, par exemple). Il existe toujours une demande non satisfaite et elle ne cesse de croître. Constamment à la recherche d’innovation et de nouveaux produits, les industriels de nombreux secteurs se sont tournés vers le laboratoire de biotechnologies de l’Ifremer et sa collection de micro-organismes issus de l’hydrothermalisme marin. Leur objectif était d’exploiter au mieux la biodiversité naturelle existante et l’immense potentiel d’activités catalytiques qu’elle possède. En effet, les études montrent qu’une petite fraction des micro-organismes (5% environ) a pour l’instant été identifiée. L’intérêt essentiel des bactéries thermophiles est, bien sûr, la résistance à de hautes températures. Un exemple : au cours de la transformation de la pâte à papier, une des enzymes (de type xylanase) doit opérer dans des conditions difficiles de solvant, de pH, etc, à haute température. Les enzymes issues des bactéries hydrothermales pourraient donc être bien adaptées à ce traitement. Les industriels recherchent aussi, avec l’utilisation des enzymes, une alternative aux procédés chimiques existants. L’action des enzymes est plus spécifique et peut se révéler moins polluante. Le marché des enzymes est en forte croissance : entre 1995 et 2000, il a été multiplié par un facteur 10. La demande est donc forte, les enzymes intervenant maintenant dans pratiquement tous les procédés agro-alimentaires : dans l’élaboration des arômes, dans la fabrication des jus de fruits, des boissons gazeuses, dans les process de clarification, dans la fabrication du pain ; et aussi, dans de nombreux autres domaines tels que l’industrie pharmaceutique, la fabrication des lessives ou l’alimentation animale (cf page suivante).
Perspectives pour l’alimentation animale Dans le domaine de l’alimentation animale, de nombreux industriels sont intéressés, aujourd’hui, par de nouvelles pistes de recherche. Les bactéries des fonds marins constituent incontestablement une piste intéressante. En effet, ces industriels qui préparent des "plaquettes" d’aliments composés pour les animaux, porcs ou volailles, recherchent des activités enzymatiques répondant à des conditions de production tout-à-fait spéciales. Qu’il s’agisse de pH, de température, de stabilité à la pression ou de la présence de solvants, par exemple. Les conditions régnant dans le milieu marin profond sont plus rigoureuses qu’ailleurs et les bactéries doivent s’y adapter pour vivre dans des conditions plus extrêmes que dans le milieu terrestre. Les industriels recherchent par l’utilisation de ces enzymes une dégradation de la paroi des végétaux qui ne peut être assimilée directement par l’animal. Il s’agit d’une recherche d’optimisation de la ressource énergétique ingérée, tout en limitant les rejets et en les rendant moins polluants. Ceci leur permettra d’entrer plus facilement dans un cadre législatif de plus en plus sévère, par exemple, sur le plan européen. L’Ifremer a répondu à une demande particulière d’industriels souhaitant améliorer leurs procédés de fabrication d’aliments destinés aux animaux. Les produits de base sont des céréales, telles que l’avoine ou le blé. Mais, entre l’épi et la plaquette nutritive ingérée par le volatile, la fabrication passe par certains stades - la dégradation de polymères tels du xylane et de l’amidon en particulier - qui doit s’effectuer à haute température, entre 70 et 110°C. Très peu d’enzymes issues d’organismes terrestres (bactéries, champignons, levures) peuvent y résister. L’Ifremer, de son côté, possède une collection de souches résistantes à la chaleur. Deux techniques ont été mises en oeuvre par le laboratoire de biotechnologies brestois : toute la collection d’isolats (1200 environ) a été passée au crible vis-à-vis des activités précises demandées, par la voie biochimique. Les résultats étant apparus positifs, une deuxième phase a porté sur l’identification de gènes "codants" pour les enzymes recherchées. C’est l’outil bio-informatique qui est alors utilisé, en comparant toutes les séquences disponibles de gènes codants pour ces activités. Une amplification par la technique de PCR (Polymerase Chain Reaction) permet ensuite aux scientifiques d’aboutir aux gènes recherchés de façon précise. Les espoirs sont fondés sur les résultats des travaux en cours actuellement : les plus récents sont prometteurs. Une compétition existe au plan mondial pour ces activités, mais l’Ifremer est particulièrement bien placé : l’avantage réside dans l’existence d’une souchothèque et aussi d’un savoir-faire en biologie moléculaire et en enzymologie. C’est un domaine d’excellence de l’Institut.
Microorganismes hyperthermophiles : comment les élever ? La culture des micro-organismes hydrothermaux en laboratoire doit permettre aux chercheurs de disposer d’une biomasse suffisante, pour des études d’enzymologie par exemple, et de pouvoir étudier avec précision la physiologie de ces organismes. Deux souches ont été prises comme modèle. La première, Pyrococcus abyssi, vient du bassin Nord-Fidjien, la seconde, Thermococcus hydrothermalis, a été récoltée sur la ride Est-Pacifique. Sur cette dernière, des activités enzymatiques intéressantes ont été identifiées notamment des enzymes impliquées dans l’industrie de l’amidon. Ces souches sont toutes deux des hyperthermophiles provenant de la paroi même des fumeurs (cheminées hydrothermales) d’où le fluide sort à une température pouvant atteindre 350°. Ces espèces sont hétérotrophes, c’est-à-dire qu’elles utilisent la matière organique comme nourriture et comme source d’énergie elles utilisent également du soufre ; en son absence les rendements de cultures en conditions classiques sont très faibles. Pour la mise en culture de ces souches, plusieurs problèmes se posaient : l’utilisation d’un milieu à base d’eau de mer, contenant de la fleur de soufre, et le travail à haute température. Ces conditions particulièrement corrosives nécessitaient l’adaptation du matériel de laboratoire courant. Les cultures se pratiquent dans des appareils appelés fermenteurs (ou bioréacteurs) et le dispositif utilisé est un fermenteur "gaz lift", adapté d’un matériel existant. C’est un appareil en colonne, traversé en continu par un fort débit d’azote, ce qui permet d’éliminer, au fur et à mesure, les produits indésirables (gaz nauséabonds ou toxiques pour les bactéries) et permet aussi de cultiver ces micro-organismes en l’absence de soufre. Ces fermenteurs, de 2 ou 5 litres, réalisent des cultures en continu. Les conditions expérimentées sur ces deux souches-modèles pourront ensuite être adaptées à d’autres espèces pour la production d’enzymes, de métabolites bio-actifs, par exemple. L’on ne sait pas encore tout sur les micro-organismes hydrothermaux, mais l’on a maintenant un outil permettant de mieux connaître leur physiologie (à quelle température optimale ils se développent, quels substrats ils utilisent, etc.) et de disposer d’une culture sur une longue période. Celle-ci peut en effet subsister, dans de bonnes conditions, plusieurs semaines, voire plusieurs mois. Les applications industrielles éventuelles sont toujours la motivation essentielle de ces travaux de recherche. Ajoutons enfin que le laboratoire de l’Ifremer de Brest est le seul en France à utiliser actuellement ces techniques de fermentation en continu comme outil d’étude de la physiologie des hyperthermophiles.
Le génie génétique traque les minuscules coupables de l’altération du saumon fumé Les microbiologistes ont maintenant des moyens supplémentaires pour détecter des populations bactériennes, d’estimer leur abondance ou de suivre leur évolution dans des produits alimentaires, grâce aux outils de la génétique. L’exemple présenté ici est celui de l’altération du saumon fumé emballé, commercialisé en grandes surfaces. Une fois expérimentée sur le saumon, cette technique pourra s’appliquer à une large gamme de produits marins. Le produit étudié est un saumon fumé, tranché et mis sous vide dans des barquettes qui sont conservées en rayon à 4°C. La méthode traditionnelle d’analyse des bactéries consiste à broyer le poisson, diluer ce broyat et l’étaler sur des boîtes de Pétri contenant un milieu nutritif. L’incubation dure cinq jours à 15°C. On identifie ensuite les bactéries qui s’y sont développées. Le problème réside dans le fait que se développe, à ce moment-là, uniquement une catégorie de bactéries pour lesquelles ces conditions sont favorables, température, oxygène, etc, pas forcément celles qui étaient dominantes et/ou les plus actives dans l’échantillon initial ! Le résultat obtenu pourrait donc être fortement biaisé. La nouvelle approche des chercheurs de l’Ifremer-Brest utilise la biologie moléculaire qui permet d’identifier les bactéries directement à partir de l’information génétique contenue dans l’échantillon. L’avantage est que cette approche ne nécessite aucune connaissance préalable des conditions de développement des bactéries présentes dans l’échantillon. La technique consiste à extraire l’ADN total du saumon fumé broyé. Puis de récupérer seulement l’ADN des bactéries en l’identifiant à l’aide d’un gène commun à toutes les bactéries (encore une fois le gène codant pour la petite sous-unité de l’ARN ribosomique). L’analyse de ces gènes comportant différentes "signatures" propres à chaque type bactérien permettra ensuite d’identifier celles qui sont présentes dans l’échantillon. Après examen de plusieurs échantillons de saumon fumé prélevés à différentes périodes de stockage, il est ensuite possible de mettre en relation le développement de certaines espèces bactériennes et la variation de la qualité sensorielle du produit, le goût, l’odeur, la texture, déterminée par le groupe d’analyses sensorielles de l’Ifremer-Nantes. Une autre application importante de ce type d’approche génétique est la mise au point de sondes qui vont reconnaître spécifiquement le matériel génétique des populations bactériennes identifiées. La fluorescence émise par ces sondes va permettre "d’allumer" les populations recherchées et de les distinguer ainsi lors de l’observation directe de broyat de saumon fumé au microscope. Cette voie de recherche nouvelle est extrêmement prometteuse et va faire l’objet, prochainement, d’une publication scientifique de l’Ifremer.
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