Laboratoire Environnement Ressources de Concarneau

Dénombrement des E. coli

• Matériels et méthodes
  

1 – Quantification des Escherichia coli dans les eaux (NF CEN ISO 9308-3 de mars 1999)

Cette méthode miniaturisée pour ensemencement en milieu liquide (Nombre le Plus Probable) vise à quantifier les Escherichia coli dans les eaux de surface et les eaux résiduaires.

L’échantillon à analyser est dilué puis ensemencé dans une série de puits d’une microplaque contenant le milieu de culture déshydraté et les dilutions sont adaptées au niveau de contamination supposé de l’eau prélevée (figure 1).

Les microplaques sont examinées sous rayonnement ultraviolet à 366 nm dans l’obscurité après une période d’incubation de 36 h minimum et 72 h maximum à 44°C ± 0.5°C. La présence d’Escherichia coli est indiquée par une fluorescence bleue résultant de l’hydrolyse du 4-Méthylumbelliféryl-b-D-glucuronide (MUG) par une enzyme (b-D-glucuronidase) présente chez cette bactérie entérique.

Le Nombre le Plus Probable (NPP) est une estimation statistique de la densité des microorganismes et des intervalles de confiance sont attachés à cette estimation moyenne.

Exemple de calcul :

Le nombre caractéristique retenu pour l’évaluation de la contamination colimétrique sera 18 – 5 – 1. Avec ce nombre caractéristique, on se réfère à la table de Mac Grady qui définit, pour chaque nombre caractéristique, un indice correspondant à la quantité moyenne de bactéries contenue dans chaque tube de la série la plus concentrée. le nombre probable d’E. coli dans 100 ml de l’échantillon analysé est obtenu ensuite en tenant compte de la quantité de la suspension mère ensemencée et de la dilution opérée (18.5.1 = 15908 E.coli/100 ml).

2 – Quantification des Escherichia coli dans les coquillages ((NF V 08-600 d’octobre 2000)

• Principe

La technique du nombre le plus probable (NPP) permet le dénombrement des Escherichia coli présumés en milieu d’enrichissement sélectif double et simple concentration.

Elle s’appuie sur l’ensemencement d’au moins trois séries de cinq tubes avec une quantité définie d’échantillon pour essai et les dilutions décimales de celle-ci :

• Culture présomptive : Ensemencement des 3 séries de cinq tubes dans un bouillon d’enrichissement sélectif double et simple concentration, le Lauryl Sulfate Tryptose (LST) puis incubation dans une l’étuve à 37°C +/- 1°C pendant 48 h +/- 2h.
   
• Culture confirmative : Pour chaque dilution, chaque tube positif, c’est à dire présentant une opacité, un trouble ou un dégagement gazeux par fermentation du lactose, est repiqué en portant une öse de 10 µl de la culture dans un tube de milieu sélectif, le bouillon EC et un tube d’eau peptonée exempte d’indole, puis incubé au bain-marie à 44°C +/- 1°C pendant 24 h+/- 1h.
  
  
• Résultat : Sera considéré comme positif tout tube qui, après repiquage, présentera à la fois un dégagement gazeux dans le milieu sélectif et une production d’indole dans l’eau peptonée à partir d’un acide aminé, le tryptophane, par adjonction du réactif d’Erlich Kovacs. Le calcul du nombre le plus probable est basé sur le nombre de tubes positifs par dilution ou « nombre caractéristique » qui permet d’estimer la concentration en microorganismes dans l’échantillon initial (loi de probabilité).